随着科研领域对类器官模型的需求日益增长，掌握类器官培养技术已成为实验技能中不可或缺的一部分。尽管不同种类的类器官在培养步骤上存在细微差异，但它们在核心方法上具有共通性。唯创博精实验室的类器官培养攻略，让你360度无死角（组织消化解离-传代-冻存-复苏）掌握肿瘤类器官培养

 唯创博精构建的肿瘤类器官基因编辑模型

组织样本消化及铺板

1. 组织离体后先放入预冷的（4°C）组织保存液中保存（浸没整个组织）。
2. 用含有双抗（P/S）的PBS清洗三次，在立体显微镜下清除多余组织。再次清洗组织剪成大约1-3mm2的组织块，转移至15mL离心管。
3. 向离心管中加入加10 mL预冷的PBS缓冲液反复吹打多次，直至上清液清亮，弃上清。
4. 加入3ml组织消化液在37℃进行消化20-60min（消化过程中随时观察消化情况）。
5. 加入3倍消化液体积的原代细胞培养基终止消化，用枪头轻轻吹打。
6. 使用100μm滤筛进行过滤。将滤液收集到15mL离心管，于300g 4℃离心5min后移去上清
7. 加入4℃预冷的类器官培养基重悬细胞沉淀，每毫升中含有10,000个类器官（24孔板每孔含有500个类器官），吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），按1:1稀释加入基质胶，整个操作冰上进行。
8. 8并用预冷的移液器枪头分装至各个孔中。24孔板的每孔中央加入基质胶-类器官混合物50 μL。
9. 将铺好的培养板放入37℃培养箱中待基质胶凝固后，添加500μL类器官培养基进行培养。大概10-14天，多数类器官直径在200um-800um，可进行传代操作。

唯创博精构建的肠道类器官

类器官传代

1. 用细胞刮刀或上下吹打破碎基质胶，然后将类器官悬浮物转移至 15 mL 离心管中，可以加入预冷的培养基加速基质胶溶解（24孔板可以收集到一起）。
2. 4℃ 300 g 离心5分钟，从管的底部吸出培养基。
3. 每孔中加入500μL (10倍体积) TrypLE Express消化基质胶，移液管上下吸打混合，室温或37℃消化。
4. 观察到小块细胞（由2～10个细胞组成）的混合物时，消化即已完成。离心管中加入1 / 10体积的FBS，终止TrypLE Express反应，移液管轻轻吸打混匀（以消化成细胞团为主，千万不要消化成单细胞，单细胞类器官存活率低）。
5. 4℃ 300 g 离心5分钟，弃去培养基。
6. 类器官培养基重悬分离后的类器官，在24孔板的每孔中央加入50μL基质胶-类器官混合物。
7. 将培养板放入细胞培养箱内，待基质胶凝固后加入500μL类器官培养基。

唯创博精构建的小鼠肺类器官

1. 去除培养基，每个孔使用5 mL 1X PBS洗涤，弃去上清。
2. 加入1 mL类器官收获液，孵育30~60分钟，并在低温环境下轻轻晃动孔板使基质胶充分溶解。
3. 基质胶完全溶解后使用20号的注射器将类器官细胞冲洗打散（所使用的力量和速度决定推出的细胞团的大小），并转移到离心管中，4℃，500g离心5分钟，弃去上清。PS：此步也可以用TrypLE Express消化
4. 用5ml 4°C预冷的1X PBS清洗细胞并再次4℃，300g 离心5分钟,弃去上清。
5. 类器官培养基重悬分离后的类器官，在24孔板的每孔中央加入50μL 基质胶-类器官混合物
6. 将培养板放入细胞培养箱内，待基质胶凝固后加入500μL类器官培养基。

唯创博精：小鼠肺类器官肿瘤标志物鉴定

• 密度建议1：对于类器官较多的情况，通常按1:3传代，例如，24孔板收集1孔，传代3孔。
• 密度建议2：对于类器官数量较少的情况，为了维持生长所需的旁分泌信号，需要2-3孔富集到1孔。

  

唯创博精：肿瘤类器官增殖与特异蛋白的亚细胞定位

类器官冻存

1. 用基质胶收获液分解法收集类器官，不需要消化，消化后的类器官复苏活率低。

2. 在类器官指数增长期冻存（传代后的Day3-Day4），多数类器官直径在100um-200um，这个时机选择冻存。等到该传代的时候类器官活性比指数期差。

3. 冻存密度，以24孔板为例，密度建议500个类器官/mL冻存液。

4. 添加适量类器官冻存液，轻柔吹打重悬，建议立即进行冻存。（放置太久，DMSO对类器官有损伤）
5. 梯度冻存：将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

1. 将包含类器官的冻存管放入37°C水浴，并要不断地摇动，使管中的液体迅速融化。
2. 约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3. 将冻存管的内容物转移至15mL离心管中，加入10倍体积类器官培养基。用移液管轻轻吹打重悬类器官。
4. 4℃，300g离心3分钟，弃去上清液，加入培养基重悬类器官，使得每毫升中含有10,000个类器官
5. 用移液管轻轻吹打混匀，让类器官分散在基质胶中，24孔板的每孔中央加入50μL基质胶-类器官混合物。
6. 将培养板放入细胞培养箱内，待基质胶凝固后加入500μL类器官培养基。

• 组织取材：肿瘤组织为例，在无菌条件下采集肿瘤细胞集中、细胞活力良好的肿瘤组织作为样本，避开坏死部位及非肿瘤部位（如肌肉或脂肪），同时避免与水接触及交叉污染，取材离体时间不能超过10min，确保组织浸没在样本保存液中。
• 红细胞裂解液：当组织中红细胞过多时，会影响到基质胶圆顶结构的稳定性。如果收集到的细胞团沉淀呈现明显的红色，建议加入红细胞裂解液进行裂红处理后再进行种板。
• 避免气泡：基质胶与类器官混匀步骤需要在冰上进行，并尽快完成。如果不小心产生气泡可以先吸走后再进行种板。
• 类器官鉴定常用的指标：组织形态学方面，常使用HE染色、免疫组化或荧光染色观察原组织及其衍生的类器官组织的病理结构、特异性标记物的表达分布等进行一致性鉴定，以小鼠小肠类器官鉴定为例，可以使用肠绒毛标记物Villin，杯状细胞标记物Muc2，肠上皮细胞标记物E-cadherin，潘氏细胞标记物Lyz等的免疫荧光染色观察。
• 离心转速：一般选用300g或1500rpm离心3分钟，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离。
• 预冷：24孔板每孔建议加50μL基质胶，使用前需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化，枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时。
• 消化:以消化成细胞团为主，千万不要消化成单细胞，单细胞类器官存活率低。
• 类器官传代消化离心后正常情况分三层清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），如果分两层（缓冲液层和基质胶类器官混悬液层），基质胶与类器管没有完全分离，可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），如果依然是两层，此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液，保留下2/3即可。