肿瘤发生发展的核心机制之一是由关键驱动基因（如癌基因或抑癌基因）通过调控下游信号网络，影响细胞增殖、凋亡、代谢、免疫逃逸等过程。

1. 研究目标

• 明确目标基因的下游效应分子：鉴定其直接调控的靶基因、蛋白质或非编码RNA。

• 解析关键信号通路：揭示目标基因如何通过特定通路（如PI3K/AKT、MAPK、Wnt/β-catenin）影响肿瘤表型。

• 探索表观遗传调控：研究目标基因是否通过DNA甲基化、组蛋白修饰或染色质重塑影响下游基因表达。

• 临床转化价值评估：筛选潜在治疗靶点或生物标志物。
  
  

2. 研究内容与方案

（1）下游靶基因的筛选

① 转录组学分析（RNA-seq）

• 实验设计：对比目标基因敲除/过表达组 vs. 对照组的差异表达基因（DEGs）。

• 分析方法：

  • GO/KEGG富集分析（预测关键通路）。

  • GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）识别核心调控网络。

  • 结合TCGA、GTEx等数据库验证临床相关性。

② ChIP-seq（染色质免疫共沉淀测序）

• 适用场景：若目标基因是转录因子（如MYC、TP53、STAT3）。

• 实验流程：

  • 使用特异性抗体富集目标基因结合的DNA片段，测序分析结合位点。

  • 结合Motif分析（如JASPAR数据库）预测直接靶基因。

③ 蛋白质组学（质谱分析）

• 适用场景：若目标基因编码蛋白激酶、泛素连接酶等调控蛋白稳定性或翻译后修饰的分子。

• 实验方法：

  • 免疫共沉淀（Co-IP）+ 质谱鉴定互作蛋白（如USP28调控MYC稳定性）。

  • 磷酸化蛋白质组学（如激酶底物筛选）。
    
    

（2）关键信号通路验证

① 经典通路检测（Western blot / qPCR）

• 常见通路：

  • PI3K/AKT/mTOR（增殖、代谢）。

  • MAPK/ERK（迁移、侵袭）。

  • Wnt/β-catenin（干细胞特性）。

  • Hippo/YAP（机械应力响应）。

• 实验策略：

  • 检测关键蛋白磷酸化水平（如p-AKT、p-ERK）。

  • 使用通路抑制剂（如LY294002、U0126）验证功能依赖关系。

② 报告基因实验（Luciferase assay）

• 适用场景：验证目标基因是否调控特定启动子/增强子活性。

• 实验方法：

  • 构建含目标基因结合位点的荧光素酶报告质粒。

  • 共转染目标基因表达载体，检测荧光信号变化。

③ CRISPR/Cas9 筛选

• 适用场景：若目标基因调控多条通路，可进行功能依赖性筛选。

• 实验设计：

  • 在目标基因敲除背景下，使用通路特异性sgRNA文库（如激酶文库）筛选合成致死基因。

（3）表观遗传调控机制

① DNA甲基化（WGBS / MeDIP-seq）

• 实验方法：

  • 全基因组甲基化测序（WGBS）分析目标基因是否影响全局甲基化模式。

  • 结合RNA-seq数据，鉴定差异甲基化-差异表达基因（如抑癌基因沉默）。

② 组蛋白修饰（ChIP-seq / CUT&Tag）

• 实验方法：

  • 检测目标基因是否招募组蛋白修饰酶（如EZH2、HDACs）。

  • 分析H3K27me3（抑制性）、H3K4me3（激活性）等修饰变化。

③ 非编码RNA调控

• 实验策略：

  • RIP-seq（RNA免疫沉淀测序）鉴定目标基因结合的miRNA/lncRNA。

  • 构建ceRNA网络（如circRNA-miRNA-mRNA轴）。

（4）功能验证（体外 & 体内）

① 体外实验

• 细胞表型检测：

  • 增殖（CCK-8/EdU）、凋亡（Annexin V）、迁移（Transwell）、干性（肿瘤球形成）。

• 挽救实验（Rescue assay）：

  • 在目标基因敲除背景下，回补下游效应分子（如过表达AKT逆转增殖抑制）。

② 体内实验

• 小鼠模型：

  • 皮下/原位移植（检测肿瘤生长、转移）。

  • 条件性敲除（如Cre-LoxP系统）研究组织特异性效应。

• 类器官/PDX模型：

  • 在临床相关模型中验证机制（如患者来源类器官对通路抑制剂的响应）。